Явление+кластерной+кристаллизации+криопротекторных+растворов

**ЯВЛЕНИЕ КЛАСТЕРНОЙ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ КРИОПРОТЕКТОРНЫХ РАСТВОРОВ **



**ВВЕДЕНИЕ**
Данные о температурных интервалах и особенностях кинетики перехода водных растворов криопротекторных веществ из жидкого в твёрдое аморфное состояние очень важны для [|криобиологии]. Практика показывает, что без них невозможно разработать эффективные режимы охлаждения – нагрева и хранения криоконсервируемых биообъектов. Прежде всего это связано с тем, что к скорости изменения температуры криоконсервируемых биосистем, выше и ниже температуры стеклования Tg, предъявляются прямо противоположные требования. Выше температуры Tg как охлаждение, так и нагрев биообъектов в большинстве технологических подходов рекомендуется проводить с достаточно высокими скоростями. Это позволяет предотвратить контакт клеток с высококонцентрированными растворами, которые образуются в процессе роста внеклеточных кристаллов льда в замораживаемой суспензии клеток. Высокие скорости изменения температуры, ниже температуры Tg, приводят к возникновению термоупругих напряжений первого рода и, как следствие, к значительным механическим повреждениям биообъектов в результате пластической релаксации этих напряжений.

Уменьшить повреждение клеток за счёт термоупругих напряжений можно снижением скоростей охлаждения и нагрева биообъектов при температурах, меньших температуры Tg. Ясно, что подобрать оптимальный режим охлаждения или нагрева можно, если известна зависимость температуры стеклования Tg от концентрации криопротекторного вещества Скр, особенно в области малых значений Скр (5%≤ Скр ≤10%), так как именно эти концентрации часто используются в практической [|криобиологии]. В указанном интервале концентраций криопротектора жидкие фракции вблизи температуры стеклования существуют в виде небольших замкнутых включений. Образование микрокристаллов льда в них с точки зрения сохранения биообъектов нежелательно как непосредственно до стеклования внеклеточного криозащитного раствора, так и после расстеклования на этапе отогрева.

В своей дипломной работе для исследования особенностей кристаллизации криопротекторных растворов мною был применён метод объёмной сканирующей дилатометрии, акцентирующийся на зависимости изменения объёма вещества при изменении температуры, который на данный момент является наиболее приемлемым из используемых методов экспериментального изучения кристаллизации криопротекторных растворов, поскольку по получаемому по его применению графика изменения объёма криопротекторного раствора можно точно определить начало кристаллизации несвязанной молекулами криопротектора воды, при которой доселе уменьшающаяся разница объёмов эталонной и исследуемой ячеек начинает резко (при малой концентрации криопротекторного раствора – следовательно, большому количеству несвязанных молекулами криопротектора молекул воды) или же более плавно (при возрастающей концентрации криопротекторного раствора) возрастать, выходя после этого на плато, что свидетельствует о начале стеклования криопротекторного раствора.

Также следует упомянуть тот факт, что метод объёмной сканирующей [|дилатометрии] (тензодилатометрии) является более удобным, нежели метод термопластического анализа, в случае Т > Tc, когда эффективность последнего снижается в силу резкого падения вязкости исследуемых образцов (соответственно, увеличении их скорости пластического течения). Также его преимущество состоит в том, что с помощью полученных дилатограмм можно исследовать тонкие аспекты кинетики кристаллизации криопротекторного раствора и получать более полные диаграммы состояний, учитывающие множество особенностей, в том числе и кластерную кристаллизацию.



**КЛАСТЕРНАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ. СУТЬ И ОСОБЕННОСТИ**
Обычно предполагается, что процесс кристаллизации охлаждаемого раствора L определяется только уменьшением свободной энергии системы за счёт кристаллизации компонентов и её увеличением за счёт образования межфазных границ. При таком рассмотрении не учитываются силы связей молекул в исходном растворе, которые могут оказывать существенное влияние на кинетику его кристаллизации. Такое влияние особенно существенно при охлаждении криопротекторных растворов, при кристаллизации которых в области температур порядка -40°С и ниже концентрация остающейся жидкой фазы достигает значений, при коих молекулы воды основное время находятся не в свободном состоянии, а в комплексах с молекулами криопротекторного вещества. В этом случае критический зародыш новой фазы сможет образоваться только при одновременном протекании двух статически независимых процессов – разрыва связей «вода-криопротектор» и создания кристалла льда необходимых размеров. С учётом этого энергия активации зародышеобразования будет отличаться от известных классических аналогов, что может приводить к не рассматривавшемуся ранее явлению кластерной кристаллизации.

Для иллюстрации вышеуказанного предположения рассмотрим кристаллизацию бинарного раствора «А+В», описываемую диаграммой [|эвтектического] типа. Пусть его исходная концентрация СВ′<Ceut, где СВ – концентрация компонента В, меняющаяся в интервале 0…1, и Ceut – эвтектическая концентрация. С учетом взаимодействия между молекулами компонентов А и В, эффективная высота энергетического барьера ΔG, разделяющего кристаллическое и жидкое состояния, будет определяться следующими выражениями:

ΔG = ΔGAL + GσA + jE*A-B, при Teut < T < TL (2.1)

ΔG = ΔGAL + ΔGBL + GσA + GσB + jEA-B, при T = Teut (2.2)

Здесь GσA и GσB – увеличение свободной энергии системы за счёт образования поверхностей раздела между раствором L и зародышами фаз А и В, соответственно, TL – температура начала кристаллизации раствора, соответствующая линии [|ликвидуса], Teut – температура эвтектической кристаллизации. Величины ΔGAL, ΔGBL, E*A-B и EA-B в свою очередь определяются выражениями:

ΔGAL = iAnc (gA – gAL), (2.3)

ΔGBL = iBnc (gB – gBL), (2.4)

, (2.5)

, (2.6)

где iAnc, iBnc – число молекул в критических зародышах кристаллических фаз А и В; gA, gAL, gB, gBL – значения свободных энергий, приходящихся на одну молекулу компонента А или В, находящуюся в твёрдой или жидкой фазах соответственно, E*A-B и EA-B – суммарные энергии связей между молекулами А и В, разрываемых при образовании критических зародышей фазы А при температуре Teut < T < TL и T = Teut соответственно, εnAB – энергия n-й «А-В» связи. Выражения (2.5) и (2.6) записаны для растворов, при кристаллизации которых выполняются условия:

i* = iAnc – iA0, (2.7)

iAnc > iBnc, (2.8)

где iA0 – число молекул А в составе критического зародыша, находившихся до кристаллизации в растворе в свободной состоянии. Коэффициент j в выражениях (2.1) и (2.2) учитывает влияние процесса разрыва «А-В» связей на эффективную высоту энергетического барьера, определяющего вероятность флуктуационного образования критического зародыша кристаллической фазы А. Для его количественной оценки обозначим через t0 среднее время жизни молекул А в свободном состоянии, то есть время между разрывом «А-В» связи и повторным захватом молекулы А молекулой В. Если при этом обозначить через tfa ≤ t0 время флуктуационного образования критического зародыша, для приблизительной оценки величины j можно записать:

j ~ tfa / t0, (2.9)

Согласно (2.9), при увеличении концентрации связывающего вещества В величина t0 будет уменьшаться, обеспечивая условие j → 1. Наоборот, увеличение параметра t0 обеспечивает условие j → 0, так как значение tfa в обоих случаях остаётся величиной постоянной и при малых значениях iAnc сравнимой с периодом тепловых колебаний молекул А. Согласно (2.1) и (2.2) в кристаллизующемся растворе при понижении температуры конкурируют два процесса: увеличение разности свободных энергий компонентов А и В между твёрдой и жидкой фазами и увеличение суммарной энергии разрываемых «А-В» связей при разделении компонентов А и В в процессе кристаллизации. Первый процесс приводит к уменьшению числа молекул в критическом зародыше, согласно выражению:

iAnc = [2φσ / 3(gAL – gA)]3, (2.10)

где σ – удельная поверхностная энергия, а φ – геометрический фактор. При определённых условиях это позволяет суммарной энергии ЕА-В при охлаждении раствора изменяться так, что высота энергетического барьера ΔG в температурном интервале TL > T ≥ Teut будет уменьшаться или оставаться величиной постоянной. В результате процесс кристаллизации может развиваться до достижения эвтектической концентрации в жидкой фазе с последующим образованием эвтектической смеси кристаллов А и В. Однако в реальных системах, какими, в частности, являются большинство криопротекторных растворов, и при реальных скоростях охлаждения, уже на этапе кристаллизации компонента А возможно возникновение ситуаций, при которых величина jE*A-B резко увеличивается с понижением температуры. Это характерно для тех случаев, когда для образования зародышей фазы А в растворе не хватает свободных или слабо связанных молекул компонента А и необходимо их выделение из сильно связанных состояний. Естественно, что это приведёт к ингибированию кристаллизации компонента А, то есть в растворах с таким характером связей в принципе нельзя достичь эвтектической концентрации и тем более реализовать эвтектический распад раствора на механическую смесь отдельных кристаллов А и В. Наиболее вероятным исходом при дальнейшем охлаждении таких систем является стеклование остающейся жидкой фракции. Здесь следует учитывать и тот факт, что разрыв «А-В» связей носит флуктуационный характер. Поэтому вероятность таких разрывов резко уменьшается с понижением температуры в соответствии с выражением:

, (2.11)

где ν – частота тепловых колебаний молекул А в «АВ» комплексах, k – коэффициент Больцмана. В результате скорость диссоциации «АВ»-комплексов будет крайне мала даже на фоне водородных межмолекулярных связей. В том случае, когда молекулы компонента А представляют собой молекулы воды, это исключает обычную кристаллизацию криопротекторных растворов уже при температурах ниже -40…-50°С. В то же время в них возможны процессы, позволяющие определённой части молекул воды переходить в нанокристаллы льда вплоть до температуры стеклования Tg. В их основе лежит явление агрегации молекулярных комплексов «вода – криопротектор», описываемых общей формулой AβB, где β – среднее число молекул воды, связанных с молекулой криопротекторного вещества В при температуре Tc. Основной движущей силой такой агрегации является возможность создать критический зародыш фазы А при минимальных значениях суммарной энергии разрываемых связей, то есть при условии:

EβA-B << E*A-B, (2.12)

где EβA-B – суммарная энергия разрываемых «А-В» связей при кластерной модели образования критических зародышей льда. Такая возможность в процессе охлаждения криопротекторного раствора возникает при температурах T ≤ TC (см. рис.2.1), когда размер критических зародышей кристаллов льда достигает таких значений, что они могут образовываться при соединении комплексов AβB в кластеры без разрыва или с частичным разрывом «А-В» связей.



**Рис. 2.1 – фрагмент диаграммы состояний криопротекторного раствора, охлаждаемого с различными скоростями.**

При этом необходимо только, чтобы количество молекул воды, находящихся в образуемом кластере, удовлетворяло условию для критического зародыша в конкретном температурном интервале. Естественно, что в этом случае в агрегаты будут сначала переходить комплексы с максимальным количеством связанной воды, а по мере понижения температуры в процесс будут включаться менее гидратированые молекулы. Это, в частности, означает, что кластерная кристаллизация реализуется в диапазоне температур Tc… Tg, что принципиально отличает её от эвтектической кристаллизации, протекающей при постоянной температуре T = Teut. Характерно, что данный механизм кристаллообразования может действовать главным образом за счёт вращательной диффузии молекулярных комплексов при минимальных флуктуационных перемещениях молекул воды в пространстве. Это допускает его реализацию в сверхвязких средах вплоть до температуры стеклования Tg в отличие от обычных механизмов роста кристаллов, требующих значительных диффузионных перемещений молекул воды в окружающем кристалл растворе.

Типичная структура образующихся кластеров схематически показана на рис.2.2.



**Рис. 2.2 – модель поперечного сечения кластера, образованного из 28 комплексов AβB, и содержащего 150 молекул воды в составе нанокристалла льда as.**

Из представленной схемы следует, что образующиеся кластеры не являются кристаллогидратами, которые характеризуются заданным соотношением молекул воды и криопротекторного вещества и их строго регулярным расположением в пространственной кристаллической решётке. Структура представленных агрегатов может быть в общем виде описана формулой:

[(as)M(AβB)N], (2.13)

Где M и N – число нанокристаллов льда и количество комплексов «вода - криопротектор» в кластере соответственно. На рис.2.2 показан кластер с M = 1 и N = 28, содержащий около 150 молекул воды. Однако можно представить образование агрегатов клатратного типа, в которых параметры М и N будут изменяться в пределах 1…10 и 100…1000, соответственно.

Схематическое изображение кластерной структуры охлаждаемых растворов в интервале концентраций Сс…Сg (см. рис.2.1), где не образуются обычные кристаллы льда AS, показано на рис.2.3.



**Рис. 2.3 – кластерная структура охлаждённого криопротекторного раствора в диапазоне С0…Сg и с различными температур Тс…Тg.**

Характерной особенностью такой структуры является объёмная неоднородность состава охлаждаемого раствора, возникающая в результате образования вблизи нанокристаллов aS зон, в которых концентрация молекул воды ниже средней по раствору. Следует отметить также, что в целом средняя концентрация жидкой фазы, остающейся в системе до температуры стеклования Тg, изменяется при охлаждении незначительно. Это связано с тем, что при образовании кластеров из неё выбывают как молекулы воды, так и молекулы криопротекторного вещества. Соответствующие этому процессу линии [|ликвидуса] для разных скоростей охлаждения растворов показаны на рис.2.1.

Представленная схема позволяет понять физическую природу часто наблюдаемых в криобиологическом эксперименте эффектов дополнительной кристаллизации воды при отогреве, когда режимы охлаждения и последующего отогрева замороженных криопротекторных растворов подчиняются условию:

T˙+ << T˙ˉ, (2.14)

где T˙+ и T˙ˉ – скорости нагрева и охлаждения исследуемых растворов соответственно. При этом на термограммах, получаемых с помощью [|дифференциального термического анализа] (ДТА) или [|сканирующей калориметрии], регистрируются один или два экзотермических пика, разделённые достаточно широким интервалом температур ΔТ1-2, которые соответствуют образованию кристаллов льда в процессе отогрева предварительно замороженных растворов. Для их объяснения с позиции эвтектических диаграмм состояния следует предположить, что в процессе быстрого охлаждения в кристаллизующемся растворе с начальной концентрацией СВ′<Ceut не достигается эвтектическая концентрация Ceut. Тогда образование эвтектики (as + bs) можно ожидать при последующем медленном отогреве неравновесной системы (L + As) – пик 2 при температуре Т2, если в ней до этого происходит дополнительное увеличение массы кристаллов льда Аs – пик 1 при температуре Т1 < T2. Только такая последовательность обеспечивает выполнение условия С+В → Сeut, приводящего к эвтектической кристаллизации. Здесь С+В – концентрация нагреваемого раствора, изменяющаяся от значения С+Вg в момент его расстеклования при температуре Tg до значения С+Вe = Сeut при достижении температуры эвтектики. Однако сформулированные предпосылки противоречат теоретическим оценкам и получаемым экспериментальным результатам. Во-первых, крайне мала вероятность увеличения массы кристаллов льда Аs в условиях низкой диффузионной подвижности молекул воды вблизи Tg и низкой интенсивности флуктуационных разрывов водородных связей между водой и молекулами криопротекторного вещества. Во-вторых, при данной схеме эвтектической кристаллизации пики 1 и 2 связаны условием С+Вe = Сeut и не могут разделяться широким температурным интервалом ΔТ1-2. В третьих, площадь под первым пиком тепловыделения, пропорциональная массе дополнительно образующихся кристаллов Аs, то есть величине ΔС+В = Сeut – С+Вg, должна уменьшаться по мере приближения начальной концентрации раствора С′В к Сeut. Напротив, площадь под вторым пиком тепловыделения, соответствующая кристаллизации эвтектики, при условии, что С+В → Сeut, должна возрастать, достигая максимума при С+В = Сeut. Все эти заключения не согласуются с экспериментальными фактами, что приводит к определённым противоречиям при их трактовке. В то же время все эти факты хорошо описываются в рамках кластерной модели кристаллизации. В данном случае при быстром охлаждении раствора в аморфную фракцию переходит достаточно большое количество комплексов AnB, где n≥β, которые при последующем медленном отогреве могут участвовать в образовании нанокристаллов льда aS в составе кластеров фракции βс. Схема протекания таких процессов представлена графически на фрагменте соответствующей диаграммы состояний (см. рис.2.1). Здесь линии С′1, С′2 и С′′1, С′′2 отражают изменение концентраций жидкой фазы после расстеклования системы в процессе её отогрева со скоростью T˙+ = T˙ˉ1 << T˙ˉ2 для различных исходных концентраций раствора С′В и С′′В, соответственно. Согласно представленной диаграмме, увеличение концентрации нагреваемого раствора на ΔС′1 и ΔС′′1 соответствует первому пику докристаллизации за счёт образования дополнительных кластеров сразу после расстеклования. Увеличение концентрации на ΔС′2 и ΔС′′2 соответствует второму пику докристаллизации за счёт увеличения массы кристаллов Аs, которое происходит при более высоких температурах Т > Tc. При этом пики 1 и 2 не связаны какими-либо концентрационными условиями и могут разделяться достаточно широким интервалом температур ΔТ1-2. Площадь под вторым пиком тепловыделения уменьшается при стремлении исходной концентрации к значению Сс. Естественно, что при охлаждении и последующем нагреве криопротекторных растворов в соответствии с условием:

T˙+ = T˙ˉ, (2.15)

на термограммах в интервале концентраций С0…Сg после расстеклования должен регистрироваться эндотермический пик, обусловленный плавлением кластерной фракции βс. Второй эндотермический пик, в данном случае соответствующий плавлению кристаллов льда Аs, будет регистрироваться при Т > Tc. Такой характер плавления медленно замороженных растворов хорошо подтверждается экспериментально. Таким образом, наблюдаемые особенности процессов образования кристаллов льда при нагреве быстро замороженных растворов дополнительно подтверждают рассмотренную теорию кластерной кристаллизации. В заключение следует отметить две особенности кластерной кристаллизации: Это связано с отмеченной ранее необходимостью соответствия размера критического зародыша при данной температуре тому числу молекул воды в комплексах AβB, которые могут участвовать в его образовании. При отсутствии такого соответствия образования кластеров не происходит. Достижение его при охлаждении жидкой фракции до некоторой температуры Tc1 инициирует кластерную кристаллизацию с участием «AβB»-комплексов, удовлетворяющих условию:
 * 1) Её эффективность повышается по мере увеличения энергии связей молекул воды с молекулами криопротекторного вещества.
 * 2) В отличие от роста кристаллов за счёт диффундирующих из раствора молекул, кластерная кристаллизация может протекать ступенчато.

<β>N1 = iAnc(Tc1), (2.16)

где <β> – среднее число молекул воды в комплексах «вода-криопротектор», образующих кластеры при температуре Тс1. По аналогии, следующее критическое условие:

<β1 – Δβ>N2 = <β2>N2 = iAnc(Tc2), (2.17)

достигается при температуре Тс2 = Тс1 – ΔТ и так далее. Естественно, что по мере увеличения параметров Δβ и ΔТ неравномерность температурной зависимости скорости образования кластеров будет возрастать.



**ВЫВОДЫ**
В данной работе было рассмотрено явление кластерной кристаллизации растворов с достаточно сильным [|межмолекулярным взаимодействием], позволяющее уменьшать суммарную энергию межмолекулярных связей, разрываемых при кристаллизации компонентов, нерастворимых друг в друге в твёрдом состоянии. Особое внимание было уделено кластерной кристаллизации водных растворов криопротекторных веществ вблизи их температур стеклования. В этом диапазоне температур в силу резкого уменьшения размеров критических зародышей льда и диффузионной подвижности молекул механизм кластерной кристаллизации становится особенно эффективным. Это необходимо учитывать при разработке технологий криоконсервирования биосистем.



**ИСТОЧНИКИ**

 * Термодинамические аспекты кластерной кристаллизации криопротекторных растворов, А.И.Осецкий, 2005
 * Perculiarities of state diagrams of aqueous solutions of cryoprotective agents, Alexander I. Osetsky, Cryobyology 59 (2009)
 * Ingibition of nucleation and growth of ice by polyvinilalcohol in vitrivication solution, Hai-Yan Wang, Takaaki Inada, Kunio Funakoshi, Shu-Shen Lu, Cryobyology 59 (2009)
 * Hydrogen bonding and kinetic/thermodynamic transitions of aqueous trehalose solutions at cryogenic temperatures, Jason Malsam, Alptekin Aksan, Biostabilization Laboratory, Department of Mechanical Engineering, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455
 * http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21766151